2021年7月16日，白菜网注册领取体验胡泽平课题组在《分析化学》（Analytical Chemistry）期刊在线发表题为《基于3-硝基苯肼同步衍生化羰基、羧基和磷酸基亚代谢组策略的超灵敏、宽覆盖LC-MS/MS靶向代谢组学方法》（Simultaneous 3-Nitrophenylhydrazine Derivatization Strategy of Carbonyl, Carboxyl and Phosphoryl Submetabolome for LC-MS/MS Based Targeted Metabolomics with Improved Sensitivity and Coverage）的文章，通过采用 3-NPH衍生化策略，建立了基于 LC-MS/MS 的代谢组学分析方法，该方法同时靶向含羰基、羧基和磷酸基的代谢物，具有超高的检测灵敏度和广泛的代谢物覆盖范围。此外，该方法还可以简化细胞中糖酵解、三羧酸循环和戊糖磷酸途径的代谢流分析。代谢是生命活动的基础，代谢异常与许多疾病的发生发展有着密切的关系。代谢组学是阐明代谢调控和揭示疾病机制的有力工具，在理解疾病机制、发现治疗靶标及精准医疗中发挥了重要作用。
尽管近年来代谢组学技术已经取得了显著进步，但仍然存在许多技术挑战需要解决【1-3】。当前的代谢组学方法仍不够灵敏，对代谢组的覆盖度也非常有限，尤其是在分析微量生物样本时，例如干细胞、胚胎发育样本等。因此，仍需要进一步提高代谢组学分析方法的灵敏度，以在更少量的生物样本中检测到更多的代谢物。但是，代谢物理化性质的多样性使得开发全面覆盖整个代谢组的方法变得非常困难【4,5】。
化学衍生化是提高代谢物检测灵敏度的有效手段【6-8】。然而，一种衍生化试剂通常只能与一种特定的化学基团反应【9,10】，导致目前基于衍生化的代谢组学分析技术对代谢组的覆盖范围非常有限。因此，开发一种可以同时覆盖多种功能基团的衍生化策略将对代谢组学分析大有裨益。
图1. 3-硝基苯肼衍生化策略提高代谢组检测灵敏度、拓宽覆盖度、简化代谢流分析
在本研究中，作者采用3-硝基苯肼（3-nitrophenylhydrazine, 3-NPH）作为衍生化试剂，对羰基代谢物、羧基代谢物和磷酸基代谢物进行同步衍生化，从而使用一种衍生试剂同时衍生化多种类代谢物，极大地提高了单次分析中代谢物的覆盖度。
该方法共涵盖了130种代谢物，包括了有机酸、氨基酸、糖类、核苷酸、肉碱和维生素等。通过与非衍生化方法的灵敏度进行比较，采用该衍生化方法，近 2/3 的代谢物灵敏度达到了2-300倍的提高。
同时，衍生化可以将极性代谢物转化为其疏水性衍生物，从而增强代谢物在反相色谱柱上的色谱保留行为，提高了该方法的色谱分离能力，使得多种难以区分的同分异构体通过该衍生化方法实现了良好的分离。值得一提的是，本研究首次发现3-NPH可作为磷酸基代谢物的衍生化试剂，这为该类代谢物的全面分析和拓宽代谢组学覆盖度提供了重要工具。
为了考察该方法在少量生物样品中的适用性，作者将该方法应用于 60 个小鼠卵母细胞和 5000 个小鼠造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）的代谢组学分析。
在60个卵母细胞中，该方法检测到了72种代谢物，并利用该方法获得的代谢组学数据很好地区分了卵母细胞两个发育阶段（GV期和MII期）之间代谢差异。在5000个小鼠HSC中，该衍生化方法检测到了62种代谢物，比采用非衍生化方法多检测到了17种代谢物，这其中包含了葡萄糖-6-磷酸、甘油醛-3-磷酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸等多种具有重要生物学功能的代谢物。
此外，在该研究中，作者发现糖酵解、三羧酸循环和戊糖磷酸途径中的许多代谢物在衍生化后可产生高强度的来源于衍生化试剂的质谱裂解碎片，采用该裂解碎片进行代谢流分析，大大减少了代谢流分析中需要监测的代谢物离子对的数量，并且避免了推断代谢物质谱碎裂行为的繁琐工作，从而简化了代谢流分析流程。
图2. 代谢流分析监测的衍生物碎片离子结构图
综上，这种基于 3-NPH 衍生化的新方法具有极高的检测灵敏度、代谢物覆盖度和良好的色谱分离度，并且能够简化代谢流分析。该方法有望广泛应用于多种代谢研究，尤其是针对微量生物样本的代谢研究。
白菜网注册领取体验博士博士后孟祥骏、庞欢欢为该论文的共同第一作者。白菜网注册领取体验胡泽平研究员为通讯作者。首都医科大学李兵辉教授、白菜网注册领取体验颉伟、王建伟等教授对该研究提供了大力支持和帮助。该研究工作得到了国家自然科学基金委“糖脂代谢的时空网络调控”重大计划的重点项目、科技部“发育编程及其代谢调节”重点专项、清华-北大联合生命中心等项目支持。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c00767
参考文献：
(1) Li, Y.; Bouza, M.; Wu, C.; Guo, H.; Huang, D.; Doron, G.; Temenoff, J. S.; Stecenko, A. A.; Wang, Z. L.; Fernández, F. M. Sub-nanoliter metabolomics via mass spectrometry to characterize volume-limited samples. Nat. Commun. 2020, 11, 5625.
(2) Newgard, C. B. Metabolomics and Metabolic Diseases: Where Do We Stand? Cell Metab. 2017, 25, 43-56.
(3) Agathocleous, M.; Meacham, C. E.; Burgess, R. J.; Piskounova, E.; Zhao, Z.; Crane, G. M.; Cowin, B. L.; Bruner, E.; Murphy, M. M.; Chen, W.; Spangrude, G. J.; Hu, Z.; DeBerardinis, R. J.; Morrison, S. J. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature 2017, 549, 476-481.
(4) Chen, Y.; Zhou, Z.; Yang, W.; Bi, N.; Xu, J.; He, J.; Zhang, R.; Wang, L.; Abliz, Z. Development of a Data-Independent Targeted Metabolomics Method for Relative Quantification Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2017, 89, 6954-6962.
(5) Zhao, S.; Li, H.; Han, W.; Chan, W.; Li, L. Metabolomic Coverage of Chemical-Group-Submetabolome Analysis: Group Classification and Four-Channel Chemical Isotope Labeling LC-MS. Anal. Chem. 2019, 91, 12108-12115.
(6) Vuckovic, D. Improving metabolome coverage and data quality: advancing metabolomics and lipidomics for biomarker discovery. Chem. Commun. (Camb.) 2018, 54, 6728-6749.
(7) Higashi, T.; Ogawa, S. Derivatization-based sample-multiplexing for enhancing throughput in liquid chromatography/tandem mass spectrometry quantification of metabolites: an overview. J. Chromatogr. A 2020, 1634, 461679.
(8) Zhang, H.; Shi, X.; Vu, N. Q.; Li, G.; Li, Z.; Shi, Y.; Li, M.; Wang, B.; Welham, N. V.; Patankar, M. S.; Weisman, P.; Li, L. On-Tissue Derivatization with Girard's Reagent P Enhances N-Glycan Signals for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Sections in MALDI Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 2020, 92, 13361-13368.
(9) Zhao, S.; Li, L. Dansylhydrazine Isotope Labeling LC-MS for Comprehensive Carboxylic Acid Submetabolome Profiling. Anal. Chem. 2018, 90, 13514-13522.
(10) Zhao, S.; Dawe, M.; Guo, K.; Li, L. Development of High-Performance Chemical Isotope Labeling LC-MS for Profiling the Carbonyl Submetabolome. Anal. Chem. 2017, 89, 6758-6765.
